無菌檢驗員培訓(xùn)內(nèi)容之菌種的接種、傳代
1.無菌檢驗員培訓(xùn)內(nèi)容之菌種的接種、傳代準備工作
①用具：接種環(huán)、酒精燈。
②培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂或改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基或適宜的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已干縮，無冷凝水，則不宜再使用。
③消毒液：75%酒精、0.1%新潔爾滅或84消毒液。
④菌種：根據(jù)2020年版《中國藥典》的要求，傳代次數(shù)（n）應(yīng)不超過5代。
2 將冰箱中取出的菌種斜面，在室溫放置30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室內(nèi)或超凈工作臺。
3、點燃酒精燈，將菌種管與接種管持在左手拇指、食指與中指之間，試管口斜向上，兩試管口平齊靠近火焰旁。
4、再以右手持接種環(huán)在火焰上燒紅30秒鐘，隨后將全部鉑金絲及金屬棒部分在火焰上灼燒，往返通過3次。
5、右手用無名指、小指及掌部夾住橡膠塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔出橡膠塞，夾在無名指、小指及掌部，并勿使其與任何物品接觸。
6、將灼燒過的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基上，待冷后，從斜面上挑取菌苔少許，取出時，接種環(huán)不能通過火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入至接種管內(nèi)液體培養(yǎng)基中，或在瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動，使細菌劃在斜面的表面上，注意只劃動一次，勿重復(fù)移動，且勿使菌苔沾在管壁口。
7、取出接種環(huán)，立即將管口通過火焰滅菌，右手到火焰旁將試管橡膠塞塞上，然后將接種過細菌的接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌。
8、已接種畢的各管貼好標(biāo)簽，注明菌名、編號、代次（n+1）和接種日期，細菌管置30~35℃培養(yǎng)18~24小時；真菌管一般置20~25℃培養(yǎng)24~48小時（黑曲霉需培養(yǎng)5~7天）。
9、培養(yǎng)到期后取出培養(yǎng)物，仔細觀察菌苔形態(tài)，是否正常，并與上代菌種比較，有無雜菌。必要時涂片，革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落即可作為日常工作中使用的菌種。如發(fā)現(xiàn)菌苔形狀不典型，可繼續(xù)進行平板劃線培養(yǎng)，分離單菌落，挑選典型菌苔接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，代替原有的工作用菌種。
10、檢查合格的工作用菌種，放入冰箱內(nèi)2~8℃保存，一般1個月轉(zhuǎn)種一次。菌種（第n 代）接種至適宜培養(yǎng)基中，在規(guī)定的溫度條件下的培養(yǎng)物，即為第n+1代。
注意事項：
黑曲霉致病性很強，操作時應(yīng)特別注意：
①黑曲霉孢子相當(dāng)穩(wěn)定，其在0.9%氯化鈉溶液中，4℃左右的條件下可以保存較長的時間，故可將此孢子懸液作為儲備液在1~2月內(nèi)使用，以減少反復(fù)操作的風(fēng)險性。
②為防止黑曲霉孢子的傳播，接種傳代時應(yīng)關(guān)閉風(fēng)機，近酒精燈操作。
③ 接種傳代時，斜面必須是干燥的，否則影響其孢子的形成。
④ 接種傳代后，使用過的器具均需在121℃下，經(jīng)30min高壓滅菌后再作處理。
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